Ghita J. De Jongh – Protection Of Colonic Anastomoses With Collagen Meshes
SUMMARY
The aim of this study is to investigate whether a collagenous biomaterial can protect high-risk intestinal anastomoses against leakage. A protecting mesh for colonic anastomoses needs to possess certain properties that are associated with the site of implantation and the function of the organ as mentioned in Chapter I. Three types of collagen derived from the dermis of sheep were tested: Non-crosslinked (N-DSC), glutaraldehyde-crosslinked (G-DSC) and hexamethylene diisocyanate-crosslinked dermal sheep collagen (H-DSC). Two types of porcine collagen were tested: With and without hyaluronan treatment (H-PC, PC) (Chapter II). Although all meshes were supple and had sufficient initial strength, the sheep collagen meshes had a higher initial strength than the porcine collagen meshes (Chapter III). The collagen meshes were mechanically tested after in vitro incubation during 24 hours in composed gastric, bile and pancreatic fluid and a mixture of the last two. N-DSC, PC and H-PC dissolved completely after incubation in gastric fluid. Crosslinking of the sheep collagens protected the mesh against the proteolytic effect of this fluid. In the porcine collagen group, PC was completely degraded in composed pancreatic fluid (its main constituent being trypsin) by proteolysis. Surprisingly, degradation of H-PC was significantly slower than that of the same material without hyaluronan (PC), under these conditions, as has recently been found by others as well. None of the tested fluids had a significant effect on the mechanical properties of H-DSC.
Our study on implantation of the collagen meshes on the peritoneum of 45 Wistar rats (Chapter IV) showed that, within 24 hours, a fibrin layer had formed between the implanted meshes and the peritoneum. All tested meshes had amicroporous structure which allowed for cellular migration andfibrovascular ingrowth and deposition of host collagen. The inflammatory reaction to implanted sheep collagen meshes was more extensive compared to that to the porcine collagen meshes. None of the collagen meshes induced signs of rejection. N-DSC was completely resorted between 1 week and 1 month, rendering this material unsuitable for adequate protection of an anastomosis. Implantation of H-DSC in rats resulted in extensive new fibrous tissue formation that was still present after 2 months. G-DSC did not lead to extensive newtissue formation and it was resorbed between 1 and 2 months. The addition of hyaluronan to porcine collagen led to a slower degradation in vivo of the mesh collagen fibres. The specific mode of action of hyaluronan has to be further investigated to elucidate the difference in results between PC and H-PC. The elastin fibres in PC and H-PC seemed intact after 2 months. At 60 days postoperative, the peritoneum had a normal appearance or was only slightly thicker than normal, independent of the type of mesh used. The eventual total resorption of the tested sheep and porcine collagen meshes was variable, which probably reflected differences in the structure and processing of the collagen mesh and the evoked inflammation reaction. G-DSC, H-DSC, PC and H-PC meshes were applied circularly around an incompletely sutured colonic anastomosis in 32 rabbits (Chapter V). Controls were a group with normal anastomoses (control group I, n = 6) and a group with incompletely sutured anastomoses without collagen mesh application (control group II, n = 8). At autopsy at 3 weeks, the rabbits of control group II showed signs of temporary leakage and one rabbit died due to peritonitis. Apart from one covered leak that was found at microscopical examination, no clinical or radiological leak was found in the different collagen mesh groups. However, in the G-DSC, H-DSC and PC groups, severe narrowing of the lumen occurred, resulting in the death of a total of 11 rabbits. The newly-deposited tissue formed a fibrotic layer around the colon and interfered with intestinal propulsion. In contrast, H-PC resulted in healing of the anastomosis without obstruction of the colonic lumen and none of these rabbits died. Rabbits have a fragile colon with a small lumen. Nevertheless, this mesh allowed for peristaltic function of the colon. Therefore it was decided to continue the investigation in a bigger laboratory animal. G-DSC and H-PC meshes were applied around normal and around perforated (1 cm) colonic anastomoses in 33 dogs (Chapter VI). In the group with the normal anastomoses, the colon had completely healed at 3 weeks, irrespective of the type of mesh used. In the group with the perforated anastomoses, the narrowing of this anastomosis with G-DSC in the dogs was less compared to the results in rabbits and never fatal but it did impair faecal passage. Of the 13 dogs in the G-DSC group only one showed clinical leakage, no radiological leakage was discovered. Application of H-PC around these perforated anastomoses showed that the mesh could prevent leakage in 10 out of 12 dogs, moreover, without causing obstruction, which affirmed the result found in rabbits (Chapter V). Therefore, the dogs in the H-PC group lost significantly less weight than those in the G-DSC group. In the H-PC group, one clinical and one subclinical leakage occurred. The latter was a covered leakage that was discovered on routine radiological examination; this dog had an uncomplicated follow-up. The G-DSC and H-PC meshes prevented leakage by sealing the defect and serving as & scaffold for epithelial migration. At 3 months postoperative, the mucosa was (almost) continuous. The presented results in animal models suggest that a collagen mesh can prevent leakage of a perforated colon when applied circularly. Of the tested meshes, G-DSC can prevent leakage of colonic anastomoses, but H-PC most closely meets the requirements of protection of colonic anastomosis, without impairing anastomotic healing or intestinal function. We therefore conclude that in these experiments H-PC was found to be a suitable mesh for the protection of colonic anastomoses, sustaining wound healing without causing obstruction.
CONCLUDING REMARKS
Non-crosslinked dermal sheep collagen strips are approximately twice as thick and have a 13-fold higher breaking strength and a 17-fold higher elastic stiffness than porcine collagen strips.
Therefore dermal sheep collagens are more suitable if high mechanical load can be expected. The pliability of porcine collagen makes it more suitable for the studied application. In vitro, crosslinking of the dermal sheep collagen protects against the damaging effect of gastric fluid, whereas hyaluronan treatment of the porcine collagen reduces the proteolytic effect of pancreatic enzymes. Crosslinking of dermal sheep collagen as well as hyaluronan treatment of porcine collagen renders the collagen fibres less susceptible to early in vivo degradation during the inflammatory reaction. The inflammatory reaction of the peritoneum to the (non-)cross-linked sheep collagen meshes is stronger than that to the porcine collagen meshes. After application on the peritoneum of rats, N-DSC is degraded too rapidly and is thought not to be suitable for support of the high-risk intestinal anastomosis. In rats, G-DSC is completely resorbed within 2 months, whereas 3 months after implantation in dogs it is only partly degraded. Application of G-DSC and H-DSC around colonic anastomoses leads to narrowing of the colonic lumen due to the rather rigid structure. Application of PC also leads to functional obstruction.
However, after addition of hyaluronan to this collagen mesh, no obstruction was seen. Application of G-DSC and H-PC around perforated (1 cm) anastomoses in dogs led to one clinical leak (8%) in each group. In the H-PC group, one covered radiologic leak (8%) was found, without clinical symptoms. Three weeks after implantation, the mesh fibrils of H-PC were covered with proteoglycans at regular intervals albeit in smaller
quantity than on normal autologous collagen fibres. This might indicate its good biocompatibility. Both G-DSC and H-PC meshes served well as a scaffold for epithelial migration of the mucosa over the perforation in the
colonic wall. In dogs, the G-DSC mesh around the perforated anastomosis was partly resorbed 3 months after implantation, whereas the H-PC
mesh was almost completely resorbed; only remnants of elastin fibres were present. In dogs, application of G-DSC and H-PC around perforated anastomoses can prevent leakage. G-DSC and H-PC groups show repair of the
colonic wall and prevention from leakage of the perforated anastomoses. G-DSC causes functional obstruction when applied circularly, whereas H-PC does not. In these experiments H-PC is found to be
a suitable mesh for the protection of colonic anastomoses, sustaining woundhealing without causing obstruction.
SAMENVATTING
In hoofdstuk I wordt ingegaan op het feit dat dehiscentie van anastomoses na resectie van het colon of rectum nog steeds een belangrijke oorzaak is van postoperatieve morbiditeit en mortaliteit. De intestinale operatietechnieken die vandaag de dag gebruikt worden zijn ontwikkeld in de negentiende eeuw; ook in die tij d waren deze ingrepen geassocieerd met hoge lekkage kansen en aanzienlijke mortaliteit. Tegenwoordig ontwikkelt gemiddeld 15% van de patiënten die een lage anterior resectie ondergaan een klinisch manifeste lekkage. Dit percentage is 30% wanneer ook röntgenologisch naar lekkage gezocht wordt. De gerapporteerde mortaliteit wisselt van 0 tot 50%. In de zeventiger jaren zijn staplers geïntroduceerd in een poging de anastomose techniek te verbeteren. Het grote voordeel van deze instrumenten is dat zeer lage anastomoses technisch makkelijker te verwezenlijken zijn; de klinische en radiologische lekkage percentages zijn echter niet verbeterd. Dehiscentie van de anastomose is geassocieerd met een twee maal langere ziekenhuis opname en een drie maal hogere postoperatieve mortaliteit. Bovendien is lekkage geassocieerd met het ontwikkelen van adhesies en de vorming van stenose. De integriteit van de intestinale anastomose wordt bepaald door een nauwgezette balans tussen postoperatieve collageen opbouw en afbraak. De structuur veranderingen in de collagene vezels zouden ook invloed kunnen hebben op de sterkte van de anastomoses. Er zijn vele systemische en lokale factoren die een nadelige invloed kunnen uitoefenen op de anastomose. Enkele systemische factoren zijn hypovolemie, ondervoeding en de toediening van steroïden. Insufficiënte bloedtoevoer en spanning over de anastomose worden gerekend tot de lokale risicofactoren. Verder is de plaats van de anastomose -zoals bij de distale colon- en rectumnaad en de oesofagusnaad- een belangrijke risicofactor. De extraperitoneale situering zou hierbij een rol kunnen spelen. Het doel van deze studie is te onderzoeken of een collageen biomateriaal een risicovolle intestinale anastomose kan beschermen tegen lekkage. Een beschermende mesh moet specifieke eigenschappen bezitten die geassocieerd zijn met de plaats van toepassing, zoals ook uiteengezet in hoofdstuk I. In hoofdstukII worden de verschillende gebruikte technieken uitvoerig beschreven. Methoden die specifiek zijn voor een bepaald onderzoek, worden beschreven in het desbetreffende hoofdstuk. In hoofdstuk III wordt het onderzoek beschreven, naar het effect van de inwerking in vitro van vloeistoffen uit het gastrointestinale kanaal op de collageen meshes. De geteste collageen meshes zijn: ongelooid, glutaaral-dehyde-gelooid of hexamethyleen diisocyanaat-gelooid schapecollageen (achtereenvolgens N-DSC, G-DSC en H-DSC) en varkenscollageen met of zonder hyaluronan behandeling (H-PC en PC). De kunstmatig samengestelde vloeistoffen waren: maagsap, gal, pancreas vloeistof en een mengsel van de laatste twee. Na 24 uur incubatie in de vloeistoffen bij 37 °C werd de breeksterkte, de maximale rek en de elastische stijfheid van de meshes bepaald. De breeksterkte van N-DSC na incubatie in controle vloeistof bleek dertien maal hoger te zijn dan die van PC, en de elastische stijfheid zeventien maal. N-DSC, PC en H-PC losten volledig op tijdens incubatie in maagsap. Looiing van het schapecollageen in G-DSC en H-DSC bood hier bescherming tegen. Na incubatie in pancreas vloeistof was PC volledig opgelost, terwijl de elastische stijfheid van N-DSC, G-DSC en H-PC aanzienlijk was afgenomen (respectievelijk p <0.0001, p = 0.0003 en p <0001). H-DSC werd niet aantoonbaar benvloed door de geteste vloeistoffen. De invloed van de gastrointestinale vloeistoffen op de mechanische eigenschappen van de onderzochte collageen meshes varieerde sterk. Onder de gekozen condities had geen van de geteste vloeistoffen had een significant effect op de mechanische eigenschappen van H-DSC. Hyaluronan behandeling van PC verminderde het effect van de proteolytische werking van pancreas vloeistof. In hoofdstuk IV werd de weefselreactie van het peritoneum op de verschillende collageen soorten bestudeerd in de rat. De implantaten waren ongelooid (N-DSC), glutaaraldehyde-gelooid (G-DSC) of hexamethyleen diisocyanaat-gelooid schapecollageen (H-DSC) en varkenscollageen met of zonder hyaluronan behandeling (H-PC en PC). De collagenen werden bij 45 Wistar ratten op het pariëtale peritoneum gehecht. Na 24 en 48 uur en na 7, 30 en 60 dagen werden de specimens onderzocht met behulp van micro-radio-angiografie, lichtmicroscopie en elektronenmicroscopie. Binnen 24 uur vormde zich een fibrine laag tussen het peritoneum en de verschillende geïmplanteerde collagenen. Het totale aantal inflammatoire cellen was hoog in de collagenen afkomstig van de dermis van het schaap vergeleken met de collagenen afkomstig van het varken. Tussen 1 week en 30 dagen werd het N-DSC volledig geresorbeerd. G-DSC werd volledig geresorbeerd in 60 dagen, terwijl er op dit tijdstip nog wel H-DSC restanten werden aangetroffen. Van het PC waren de collageen vezels tussen 30 en 60 dagen geresorbeerd, de elastine vezels leken echter onaangetast te blijven. Van het H-PC leken zowel de collageen als de elastine vezels na 60 dagen slechts minimaal aangetast. Onafhankelijk van het soort collageen had het peritoneum 60 dagen na implantatie een normaal uiterlijk of was slechts weinig verdikt. In hoofdstuk F werd de invloed onderzocht van circulair aangebrachte collageen meshes op de genezing van een onvolledig gehechte anastomose in het distale colon bij 46 konijnen. Hiervoor werd glutaaraldehyde-gelooidenhexamethyleendiisocyanaat-gelooidschapecollageen gebruikt (G-DSC en H-DSC) en varkenscollageen al dan niet behandeld met hyaluronan (H-PC en PC). Als controle dienden dieren met een normale, volledige gehechte colon anastomose (groep I) en dieren met een onvolledig gehechte anastomose (groep II), beide zonder collageen bedekking. De observatietijd was 3 weken, een aantal van de dieren met PC toepassing werd ook 3 maanden geobserveerd. Bij obductie vertoonden konijnen uit controle groep II tekenen van tijdelijke lekkage; één konijn overleed ten gevolge van peritonitis. Twee weken postoperatief werd echter geen lekkage waargenomen bij routine röntgenonderzoek. Afgezien van één afgedekt sub-klinische lek in de H-PC groep, werd er geen lekkage in de collageen groepen waargenomen. Wel trad in de G-DSC, H-DSC en PC groepen een aanzienlijke vernauwing op van het colonlumen, waardoor in totaal 11 konijnen overleden. In tegenstelling hiermee werd in de H-PC groep geen functionele obstructie waargenomen en overleed geen van de dieren. Drie weken postoperatief bleek de “bursting pressure” van het colon in alle collageen groepen verhoogd te zijn, behalve in de PC groep. Drie maanden postoperatief was het colon van de konijnen van de PC groep zonder vernauwing genezen. De “bursting pressure” was gelijk aan de uitgangswaarde en het collagene implantaat was geresorbeerd. Er werden in geen van de collageen groepen tekenen van lekkage gezien. Het colon van de konijnen was echter fragiel ten opzichte van de geteste collagenen en vertoonde een vernauwing na circulaire toepassing, met uitzondering van de konijnen in de H-PC groep. Daarom werd besloten het onderzoek voort te zetten in een groter proefdier, waardoor de afmetingen van de darm beter vergelijkbaar zouden zijn met de humane situatie. In hoofdstuk VI werden twee collageen meshes, het glutaaraldehyde-gelooide schapecollageen (G-DSC) en het varkenscollageen met hyaluronan (H-PC), nader onderzocht in honden, op hun vermogen om een geperforeerde colonanastomose te beschermen tegen lekkage waardoor een peritonitis voorkomen zou kunnen worden. Daartoe werd een distale colonresectie uitgevoerd in 33 honden. De collageen meshes werden rondom een normale anastomose aangebracht en rondom een anastomose met een full-thickness perforatie van 1 cm diameter. Bij de honden met de normale anastomose was de darm na 3 weken volkomen genezen, onafhankelijk van het type van de aangebrachte collageen mesh. In de groep met de geperforeerde anastomoses toonden alle dieren uit de G-DSC groep postoperatief tijdelijk een partiële obstructie voor faeces, terwijl in de H-PC groep geen obstructie werd gevonden. De honden in de G-DSC groep met een geperforeerde anastomose verloren significant meer lichaamsgewicht dan de honden in de H-PC groep. In beide collageen groepen werd één klinische lekkage (8%) waargenomen, gevolgd door peritonitis. In de H-PC groep werd verder één klein, afgedekt lek ontdekt tijdens routine röntgenonderzoek. Dit dier vertoonde een ongecompliceerd postoperatief vervolg. Beide meshes voldeden als overbrugging voor epitheliale migratie van de mucosa over de perforatie; 3 maanden postoperatief was de mucosa (bijna) continu, alhoewel de colonwand sneller leek te genezen in de H-PC groep. Een fascinerende waarneming was dat na implantatie van de H-PC mesh proteoglycanen in regelmatige intervallen werden afgezet op het oppervlak van deze collagene vezels. Dit in tegenstelling tot de G-DSC mesh. Het mechanisme van deze proteoglycan afzetting en de betekenis van deze waarneming zijn nog onduidelijk. Na 3 maanden was het G-DSC gedeeltelijk geresorbeerd, terwijl het H-PC bijna volledig geresorbeerd was. Toepassing van G-DSC en H-PC rondom geperforeerde anastomoses kan lekkage van deze anastomoses voorkomen. G-DSC veroorzaakt echter functionele obstructie bij circulaire toepassing, terwijl de honden met H-PC snelle genezing van de perforatie van 1 cm vertoonden, zonder obstructie. Uit deze experimenten blijkt dat H-PC een geschikte mesh is voor de bescherming van colon anastomoses, daar het de wondgenezing ondersteunt zonder obstructie te veroorzaken.